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https://ncborcherdinghttp://www.360doc.com/content/21/0715/15/vignettes/vignette.html
好了，到了你们家运来哥哥展示搬砖工基本功的时候了。
scRepertoire旨在获取来自10x Genomics Cell Ranger管道的过滤contig输出()，处理这些数据以基于两个TCR或Ig链分配克隆型，并分析克隆型动力学。后者可分为
- 1)单独克隆型分析功能，如独特克隆型或克隆空间定量;
- 2)与mRNA表达数据的相互作用，使用Seurat、singlecelperperor Monocle 3包。
一如往常我们先把环境配置好：
scRepertoire提供了一组示例数据，这些数据来自于三个肾透明细胞癌患者的T细胞，目的是为了展示R包的功能。更多关于数据集的信息可以在预印1和预印2中找到（preprint 1(https://wwwhttp://www.360doc.com/content/21/0715/15/content/10.1101/478628v1.abstract) and preprint 2(https://wwwhttp://www.360doc.com/content/21/0715/15/content/10.1101/824482v1.abstract) )。这些样本由成对的外周血和肿瘤浸润组成，有效地为T细胞受体(TCR)富集创造了6个不同的runs。我们可以使用head函数预览列表中的元素，并查看第一个contig注释。：这里注意条码贴上PX_P_ # # # # # # # # # # # # # -这是指患者X (PX)和外周血(P)。
如果你是filtered_contig_annotation.csv文件加载到R环境创建列表,您还需要调用stringsAsFactors 为 FALSE ,这将防止分类变量的转换为内置的因素和必要的一些scRepertoire的函数。代码应该看起来像这样:
对象“contig_list”是从10x Genomics Cell Ranger中的6个filtered_contig_annotation.csv文件中创建的。该对象是用contig_list <- list(csv1, csv2，…)创建的。
一些工作流中将有标准条形码标签额外的标签。在继续之前，我们将使用函数stripBarcode()来避免任何标签问题。重要的是，stripBarcode()用于删除来自其他管道的条形码上的前缀。所以你需要先看看有什么标签，以及标签的格式，同时建议对比10X的filtered_contig_annotation文件。
如果条形码为+ AAACGGGAGATGGCGT-1 + AAACGGGAGATGGCGT，则不需要stripBarcode功能。
CellRanger的输出是对TCRA和TCRB链的量化，下一步是通过细胞条形码创建一个带有TCR基因和CDR3序列的单一列表对象。这是使用combineTCR()执行的，其中的输入的是contig_list。还可以根据样本和身份信息重新标记条形码，以防止重复。如果是BCR该用什么呢？combineBCR。
cells + T-AB - T cells, alpha-beta TCR + T-GD - T cells, gamma-delta TCR
removeNA + TRUE -这是一个严格的过滤器，用于移除至少有一个NA值的细胞条码+ FALSE -包含和合并NA值为1的细胞的默认设置。
removeMulti + TRUE -这是一个严格的过滤器，可以移除任何超过2个免疫受体链的细胞条码+ FALSE -包含和合并带有> 2链的细胞的默认设置。
filterMulti + TRUE -用多个链分离细胞条形码中前2个表达的链+ FALSE -包含和合并细胞与> 2链的默认设置。
combineTCR()的输出将是一个contig数据帧列表，该列表将被简化为与单个细胞条码相关联的reads。它还会通过核苷酸序列(CTnt)、氨基酸序列(CTaa)、基因序列(CTgene)或核苷酸和基因序列的组合(CTstrict)将多个读码组合成克隆型调用。B细胞的类似函数，combineBCR()函数与2个主要注意事项类似:1)每个条码最多只能有2个序列，如果有更大的存在，选择reads值最高的2个。2)严格定义克隆型(clonotype, CTstrict)是基于v基因和>85%标准化的核苷酸序列汉明距离。汉明距离计算所有恢复的BCR序列，而不考虑运行runs。
如果除了sample和ID之外还需要添加更多的变量呢?我们可以使用addVariable()函数来添加它们。我们需要的只是要添加的变量的名称和特定的字符或数字值(变量)。作为一个例子，这里我们添加样品被处理和测序的批次。
同样，我们可以使用subsetContig()函数在combineTCR()之后删除特定的列表元素。为了进行子集化，我们需要确定要用于子集化的向量(名称)和要子集化的变量值(变量)。下面你可以看到我们从PX和PY中分离出4个测序结果。
cloneCall +“gene”-使用由TCR/Ig +“nt”组成的基因-使用CDR3区域的核苷酸序列+“aa”-使用由CDR3区域的氨基酸序列+“gene+nt”-使用由TCR/Ig组成的基因+ CDR3区域的核苷酸序列。
关于克隆型的正确定义。
需要注意的是，克隆型基本上是利用两个位点的基因组合或nt/aa CDR3序列来命名的。在scRepertoire实现中，clonotype调用没有在CDR3序列中包含小的变化。因此，gene方法将是最敏感的，而使用nt或aa则是适度敏感的，并且对克隆型最具特异性的则是gene+nt。此外，克隆型calling试图合并两个位点，即TCRA和TCRB链，以及如果单个细胞条码有多个序列被识别(即一个细胞中表达2个TCRA链)。使用10x方法有一个条形码子集，只返回一个免疫受体链，未返回链被分配一个NA值。